식품착색제 이산화티타늄 유발 DNA 손상에 대한 쓴메밀 추출물의 in vitro 항산화 효과

본 연구에 사용된 쓴메밀은 (주)봉평농원 (Pyeongchang, Korea)에서 구입하였다. 쓴메밀 10 g에 70% 에탄올(Samchun pure chemical Co., Ltd., Pyeongtaek, Korea) 200 mL를 가한 뒤 40℃에서 30분간 초음파 추출(Bransonic 5800, Branson Ultrasonics, Danbury, CT, USA)하여, 4℃에서 원심분리(14,000×g, 20분) 후 얻은 상등액을 TBE로 사용하였다(Yu et al., 2018; Jin et al., 2020).

두 가지 다른 상업용 식품첨가물 TiO₂ (T3, T4)는 제조사로부터 제공받아 사용하였으며, 선행문헌의 결과에 따라 T3와 T4를 대표적 입자크기가 큰 물질과 작은 물질로 각각 선정하였다(Hwang et al., 2019). TiO₂ 입자는 실험 직전 1 mg/mL의 농도로 distilled deionized water (DDW)에 30분간 stirring하여 분산 후, 5분 동안 초음파 처리(160 Watts, Bransonic 5800, Branson Ultrasonics)하여 사용하였다.

TiO₂의 구성 입자 크기 및 모양은 전계방출형 주사전자현미경(field emission-scanning electron microscopy, FE-SEM; JSM-7100F, JEOL, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 카본 테이프(5 mm×5 mm, E-SONG EMC, Seoul, Korea)가 부착된 마운트(Specimen Mount, JEOL) 위에 TiO₂ 용액(20 mL, 0.1 mg/mL)을 올리고 실온에서 건조한 후, 샘플 표면을 30초 동안 Pt/Pd로 코팅하여 15 kV의 가속 전압에서 FE-SEM 이미지를 획득하였다. TiO₂ 현탁액(0.1 mg/mL)의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameters)과 제타 전위(zeta potentials)는 Zetasizer Nano 시스템(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)을 이용하여 각각 동적 광산란법(dynamic light scattering)과 전기영동 광산란법(electrophoretic light scattering)으로 DDW와 세포 배양액 minimum essential medium (MEM)에서 각각 측정하였다. TBE와 rutin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 존재하 TiO₂ 입자의 유체역학적 직경은, rutin 농도가 14.2 mM이 되도록 첨가하여 측정하였는데, 이는 선행결과 rutin이 세포독성을 나타내지 않는 농도이다(Jin et al., 2020).

TBE 내 rutin 및 quercetin (Sigma-Aldrich)의 함량은 주사기 필터(0.45 µm; Advantec^®, Toyo Roshi Kaicha Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 뒤, high performance liquid chromatography (HPLC)로 diode-array detector를 이용하여 분석하였다. 고정상 Supelcosil^TM LC-18 (250 mm×4.6 mm i.d., 5 µm, Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA) 컬럼을 사용하여 1 mL/min 유속으로 20 µL를 주입하였고, methanol (Daejung chemical & metals Co., Ltd., Siheung, Korea), acetonitrile (Samchun pure chemical Co., Ltd.), 2.5% acetic acid (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA)를 1:2:7 (v/v/v) 비율로 혼합한 이동상으로 350 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량분석하였다.

TBE의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Appel et al., 2001)에 따라 분석하였다. TBE (80 µL, 156 µg/mL)에 50% Folin-Ciocalteu 시약(20 µL, Sigma-Aldrich)을 가하여 암소에서 5분간 반응시킨 후, 2% Na₂CO₃ 용액(100 µL, Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)을 가하여 30분 동안 암소에서 처리하여 microplate reader (SpectraMax^® M3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀의 함량은 tannic acid (Sigma-Aldrich)을 표준물질로 이용한 표준곡선으로부터 계산하였다.

TBE의 총 플라보노이드 함량은 Zhishen et al.의 변형된 방법에 따라 측정하였는데(Zhishen et al., 1999), TBE (50 µL)에 5% NaNO₂ 용액(30 µL, Sigma-Aldrich)을 가하여 5분간 반응시킨 후, 2% AlCl₃·6H₂O 용액(60 µL, Sigma-Aldrich)를 첨가하여 암소에서 6분 동안 반응시켰다. 1 N NaOH 용액(100 µL, Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea)을 첨가하여 11분간 반응시킨 뒤, 510 nm에서 흡광도를 측정하였다(SpectraMax^® M3, Molecular Devices). 총 플라보노이드의 함량은 (+)-catechin (ENZO Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)을 표준물질로 이용한 표준곡선에 의해 계산하였다. 상기의 두 실험 모두 TBE 내 rutin 함량을 비교군으로 이용하였다.

TBE의 항산화 활성은 2,2'-azinobis-(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS; Sigma-Aldrich)를 이용하여 측정하였는데(Lee et al., 2013; Lee et al., 2015), 10 mM ABTS 용액과 10 mM K₂S₂O₈ 용액을 7.4:2.6 (v/v)의 비율로 혼합한 후, 37℃ 암소에서 24시간 반응시켜 ABTS 라디칼을 형성하고, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 734 nm에서 0.65±0.02의 흡광도가 되도록 희석하였다. TBE 50 µL에 희석한 ABTS 라디칼 용액 150 µL를 가하여 상온 암소에서 30분간 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다(SpectraMax^® M3, Molecular Devices).

2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH; Alfa Aesar, Wardhill, MA, USA) 라디칼 소거능 분석에 의한 TBE의 항산화 활성 또한 측정하였다(Lee et al., 2013). 즉, 600 µM의 DPPH 용액을 메탄올에 제조한 뒤, 80% (v/v) 메탄올을 이용하여 517 nm에서 0.65±0.02의 흡광도가 되도록 희석하였다. TBE 100 µL와 희석한 DPPH 용액 100 µL를 혼합하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(SpectraMax^® M3, Molecular Devices). TBE의 항산화 활성은 L-ascorbic acid (Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에 해당하는 항산화력으로 나타내었다. 상기의 두 실험 모두 TBE 내 rutin 함량을 비교군으로 이용하였다.

Caco-2 장관상피 세포주를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10% 열 불활성화 fetal bovine serum, 페니실린(100 units/mL) 및 스트렙토마이신(100 µg/mL)을 함유한 MEM (Welgene Inc., Gyeongsan, Korea)에 5% CO₂, 37℃ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.

Caco-2 세포에서의 성장 저해 독성은 water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1; Roche, Basel, Switzerland) 분석법으로 평가하였다. Caco-2 세포(1×10⁴ 세포/100 µL)에 TiO₂를 단독 또는 TBE와 함께 24시간 처리하였는데, 최고 농도 292 µg/mL는 선행연구결과에 기반하여 다음과 같이 설정하였다: 품목제조보고서 기반 최대 사용량×일일섭취량 (g)/장관 부피 (100 mL) (Mudie et al., 2014; Kim et al., 2021). TBE 농도는 선행결과 세포독성이 나타나지 않는 농도로 설정하였는데, rutin 함량 기준 14.2 mM에 해당하며, 같은 농도의 표준물질 rutin을 비교 대조군으로 이용하였다(Jin et al., 2020). WST-1 시약(10 µL)을 첨가하여 4시간 동안 배양한 후, microplate reader (Infinite^® M Plex, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 440 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 3반복 후 재현성을 다시 확인(n=3)하여 평균±표준편차로 나타내었다.

세포 내 생성된 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)은 세포막 투과성 2',7'-dichlorofluoroescein diacetate (H₂DCFDA; Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)를 이용하여 분석하였다. Caco-2 세포(1×10⁴ 세포/100 µL)에 TiO₂를 단독으로 6시간 처리하거나, TBE 또는 rutin을 18시간 선처리하고 TBE 또는 rutin 존재하에 TiO₂를 6시간 처리한 후, 비형광성 H₂DCFDA (20 µM, 100 µL)를 첨가하여 암소에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척한 후, 세포 내 esterase에 의해 탈아세틸화되고 ROS와 반응하여 형광을 나타내는 dichlorofluorescein (DCF)를 excitation 파장과 emission 파장 각각 485 nm와 535 nm에서 측정하였다(Infinite^® M Plex, Tecan).

산화스트레스의 지표로서 catalase (CAT)와 superoxide dismutase (SOD) 활성은 세포(1×10⁶ 세포/2 mL)에 TiO₂를 단독으로 6시간 처리하거나, TBE 또는 rutin을 18시간 선처리하고 TBE 또는 rutin과 함께 TiO₂를 6시간 처리한 후, 각각 CAT와 SOD 분석 kit (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 모든 실험은 3반복 후 재현성을 다시 확인(n=3)하여 평균±표준편차로 나타내었다.

Caco-2 세포(1×10⁶ 세포/2 mL)에 TiO₂를 단독 처리하거나, TBE 또는 rutin을 18시간 선처리한 후 TBE 또는 rutin 존재 하에 TiO₂를 6시간 추가 노출시켰고, 양성대조군으로 H₂O₂ (100 µM)를 이용하였다. Ethylene-diamine-tetraacetic acid 용액 (5 mM, 1 mL)을 40초 동안 처리하여 스크래퍼로 회수한 세포를 원심 분리하고 차가운 PBS 용액에 현탁(1×10⁵ 세포/1 mL)한 후, R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)의 CometAssay^® kit를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 최종적으로 Axioskop 2 plus 형광현미경과 Cometscore 2.0 이미지 분석 소프트웨어(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 Comet 슬라이드에 대한 디지털 이미지 분석을 통해 comet tail의 길이를 측정하였으며, 전체 DNA 중 tail이 차지하는 DNA 백분율(%)을 수식[(tail 내 DNA 양/총 DNA 양)×100]에 의거하여 도출하였다. Comet 분석은 3반복 후 재현성을 다시 확인(n=3)하여 평균±표준편차로 나타내었다.

모든 실험 데이터는 평균값±표준편차로 표기하였으며, Statistical Analysis System 소프트웨어(Version 9.4, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였다. 각 군 간의 유의성 검정은 Tukey의 다중비교 검증을 통해 p<0.05 수준에서 실시하였다.

두 가지 식품첨가물 TiO₂의 구성입자 및 모양을 FE-SEM을 이용하여 분석한 결과, 구형의 불규칙한 모양으로 관찰되었고, 평균 구성입자크기는 T3는 160.1±27.6 nm, T4는 120.3±24.1 nm로 측정되었다(Fig. 1, Table 1). 특히, T3의 경우 100 nm 미만의 입자가 관찰되지 않고 100~200 nm 크기가 99%를 구성하고 있는 것으로 나타난 반면, T4는 100 nm의 입자가 17% 존재하여 입자분포도에 있어서 차이가 있는 것으로 측정되었다. 즉, T3가 T4에 비하여 구성입자 크기가 유의적으로 더 큰 것을 확인할 수 있었다(Hwang et al., 2019; Jeong et al., 2025). 나노물질 정의에 따르면 평균 입자크기의 50% 이상이 1~100 nm 범위에 해당해야 나노물질로 분류된다(EFSA, 2016). 이러한 기준에 비추어 볼 때, 본 결과는 식품첨가물 TiO₂가 나노물질에 해당되지 않음을 의미하며, 이는 선행문헌과 일치하는 결과이다(Hwang et al., 2019; Jeong et al., 2025).

Fig. 1. (A, B) Field emission-scanning electron microscopic (FE-SEM) images and (C, D) constituent particle size distributions of food-grade TiO₂ particles (T3 and T4). Particle size distribution was analyzed by measuring 100 randomly selected particles from the FE-SEM micrographs.

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두 물질의 유체역학적 직경은 DDW와 세포배양 조건을 감안한 MEM에서 각각 측정하였으며, 두 물질 모두 DDW 분산 시보다 MEM 분산의 경우 유체역학적 직경이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(Table 2, p<0.05). 이는 세포배양액 내 단백질, 아미노산 및 무기물질 등 다양한 영양성분과 TiO₂가 상호작용하여 입자표면에 코로나(corona)를 형성했기 때문인 것으로 판단된다(Peng et al., 2015; Gräfe et al., 2016; Jeong et al., 2025). 한편, TiO₂의 유체역학적 직경은 DDW와 MEM 조건에서 모두 TBE 존재 시 유의적으로 증가하였으나, rutin이 존재할 경우 유의적 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05). 이는 rutin과 상호작용을 통해 TiO₂의 분산 안정성이 향상될 수 있음을 의미하며, rutin이 capping agent로 작용하여 무기 나노입자를 안정화한다는 선행 연구결과와 일치한다(Joo & Chung, 2019; Łabuz et al., 2019). 한편, TiO₂의 유체역학적 직경이 FE-SEM에 의한 구성입자크기 대비 크게 증가하여 응집된 상태로 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 실질적으로 식품이나 생체 내에서는 벌크한 응집체로 존재함을 의미한다.

HPLC를 이용하여 TBE의 주요 기능성 성분인 rutin 함량과, 메밀 씨앗 내 rutin 3-glucosidase의 작용으로 rutin이 분해되어 생성되는 quercetin의 함량을 분석하였다. 그 결과, rutin과 quercetin 함량은 각각 229 ppm과 19 ppm으로 분석되었고(Fig. 2), rutin이 주된 기능성 성분으로 존재하고 있음을 확인하였다(Jin et al., 2020).

Fig. 2. Standard curves for (A) rutin and (B) quercetin, and (C) the quantification of these compounds in TBE by HPLC.

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또한 TBE는 항산화 성분을 다량 함유하고 있는 것으로 알려져 있어 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였다. 이때, rutin이 폴리페놀계 플라보노이드 화합물이므로, HPLC로 정량한 TBE 내 rutin 함량에 해당하는 동량의 rutin을 비교군으로 사용하였다. 그 결과, TBE의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 rutin 대비 약 1.6배 및 1.3배 높은 것으로 나타나(Fig. 3A, B), TBE 내 rutin 외 다른 폴리페놀 및 플라보노이드 성분들이 존재함을 알 수 있다(Jin et al., 2020; Vieira et al., 2022). 향후 이러한 다양한 폴리페놀 및 플라보노이드 성분에 대한 LC-MS 분석 기반의 프로파일링 연구가 수행되어야 할 것으로 보인다.

Fig. 3. (A) Total polyphenol and (B) total flavonoid contents, and (C) ABTS and (D) DPPH radical scavenging activities of TBE compared with an equivalent amount of rutin standard. ^*Denotes significant differences between TBE and the rutin standard (p<0.05).

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항산화 활성으로 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과, TBE의 라디칼 소거능이 rutin 대비 각각 약 2.0배 및 1.5배 높은 것으로 나타났는데(Fig. 3C, D), 이 역시 rutin 외 다른 기능성 성분들이 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능에 기여하고 있음을 보여준다.

선행연구에서 식품첨가물 TiO₂는 사용량 기반 최고 농도인 292 µg/mL까지 세포성장을 저해하거나 사멸을 유발하지 않는 것으로 보고되었으나(Jeong et al., 2025), 본 연구에서는 TiO₂와 TBE 또는 rutin과의 상호작용이 세포독성에 미치는 영향을 세포성장 저해 관점에서 추가 평가하였다. 그 결과, 두 가지 TiO₂ 단독 처리 시(세포배양액 MEM 조건)와 TBE 또는 rutin과 함께 24시간 처리할 경우 모두 세포성장 저해를 유발하지 않았다(Fig. 4A, B).

Fig. 4. (A, B) Effect of the presence of TBE or rutin on cell proliferation inhibition caused by TiO₂ particles (T3 and T4) in Caco-2 cells. (C, D) Intracellular ROS generation and (E, F) CAT and SOD activities in Caco-2 cells following pre-treatment with TBE or rutin and subsequent exposure to TiO₂ particles. Different lowercase letters (a~d) above bars indicate significant differences among different samples (p<0.05). ^*Denotes significant differences compared to untreated control cells. TBE, Tartary buckwheat extract; R, rutin trihydrate; MEM, minimum essential medium; DCF, dichlorofluorescein fluorescence; CAT, catalase; SOD, superoxide dismutase.

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한편, TiO₂는 자외선 빛을 받아 전자-정공을 생성하고, 정공의 산화작용과 전자의 환원작용을 통해 ROS를 생성하여 광촉매 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있는데(Etacheri et al., 2015), 세포수준에서도 ROS를 생성하여 산화스트레스를 유발하는 것으로 보고된 바 있다(Dorier et al., 2017; Hwang et al., 2019). 기능성 성분들이 질병의 치료보다는 예방 측면에서 유용하다는 점을 고려하여, TBE를 선처리한 후 TiO₂와 함께 6시간 동안 노출시켜 세포 내 ROS 생성능을 비교하였다. Fig. 4C와 D에서 보듯이, T3와 T4 물질 모두 73 µg/mL 이상에서 농도 의존적으로 ROS를 생성하였으며, TBE 또는 rutin과 함께 처리 시 TiO₂에 의한 ROS 생성률이 모든 농도에서 대조군 세포 수준으로 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 이는 TBE 또는 rutin이 TiO₂의 세포독성에 영향을 미치지 않으면서(Fig. 4A, B) ROS 생성을 효과적으로 저해하는 것으로, TBE 또는 rutin의 항산화 활성과 밀접하게 관련이 있는 것으로 보인다(Fig. 3).

TiO₂에 의해 생성된 ROS를 소거하기 위해 세포 내 항산화효소 활성이 증가하는지 확인하고자, CAT와 SOD 효소 활성을 분석하였다. Fig. 4E와 F에서 보듯이, 두 가지 TiO₂ 단독처리 시 CAT와 SOD 효소 활성이 대조군 대비 유의적으로 증가하였고(p<0.05), TBE 또는 rutin과 함께 처리 시 항산화효소 활성이 TiO₂ 단독처리군보다 유의적으로 더욱 증가하였다(p<0.05). 특히 TBE와 함께 처리 시 항산화효소 활성이 가장 높게 측정되어, rutin 외 다른 성분들도 항산화 효과에 기여하는 것으로 보인다. 이러한 결과는 TBE와 rutin이 항산화효소의 활성을 향상시킴으로써 항산화 기능성을 발휘함을 직접적으로 보여준다(Lee et al., 2013; Jin et al., 2020; Li et al., 2024).

Comet 분석을 이용하여 두 가지 식품첨가물 TiO₂ 단독처리에 의한 DNA 손상 여부를 평가하였는데, 이는 겔 전기영동 시 손상되어 절단된 DNA 조각들이 핵 외부로 이동하여 혜성 꼬리(comet tail) 모양을 형성하는 원리를 이용하는 기법이다. Comet 분석은 염색체 이상 시험이나 소핵 시험과 달리 DNA 손상을 정량적으로 측정할 수 있어, 초기 유전독성을 평가하는데 유용한 방법이다(Nam et al., 2025). Fig. 5에서 보듯이, 두 가지 식품첨가물 TiO₂ 단독처리에 의해서 DNA tail이 유의적으로 증가하기는 하나(p<0.05), 양성대조군 H₂O₂에 의한 DNA tail 생성량보다는 명확히 적은 것으로 나타났다. 선행연구에서 식품용 첨가물 TiO₂ (T3 및 T4)가 세포막 손상으로 인한 lactate dehydrogenase 용출이나 세포사멸(apoptosis)을 유발하지 않는 것으로 보고된 바 있으므로(Hwang et al., 2019), 본 연구에서 관찰된 DNA 손상은 apoptosis에 따른 2차적 DNA 단편화가 아닌 TiO₂에 의한 직접적인 손상 결과임을 시사한다. TiO₂의 광촉매 특성으로 인한 ROS 생성과 이로 인한 세포수준 DNA 손상은 이미 보고된 바 있다(Jeong et al., 2025; Nam et al., 2025). 한편, TBE와 rutin 존재하에 TiO₂에 의한 DNA 손상이 유의적으로 감소하였는데, TiO₂에 의한 산화스트레스 유발을 고려하면(Fig. 4C, D), TBE와 rutin의 항산화활성에 기인한 것으로 보인다(Fig. 3, Fig. 4E, F). 즉, TiO₂에 의한 DNA 손상이 산화스트레스와 연관되어 있음을 입증한다 할 수 있다. 비록 TiO₂에 의한 DNA 손상 정도가 TBE 및 rutin과 병용처리 시 대조군 수준으로 감소하지는 않았지만, 이러한 결과는 TBE의 항산화 기능성을 입증하는 것으로, 섭취 수준 및 기간에 따라 유전독성을 억제할 수 있는 잠재력을 보유하고 있음을 시사한다. TBE의 유전독성 완화 효과를 명확히 입증하기 위해, 다양한 세포주로의 확장 연구와 함께 세포신호전달체계를 포함한 세부 메커니즘 규명 및 생체 내(in vivo) 검증이 추가적으로 요구된다.

Fig. 5. (A) DNA damage (%) and (B) comet assay images of Caco-2 cells following pre-treatment with TBE or rutin and subsequent exposure to TiO₂ particles (T3 and T4). All images were magnified at 20×. Different lowercase letters (a~d) above bars indicate significant differences among different samples treated. TBE, Tartary buckwheat extract; R, rutin trihydrate; MEM, minimum essential medium.

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