분리완두단백으로부터 제조된 열 유도 겔의 구조 및 유변학적 특성 조사

분리완두단백(Pea protein isolate: PPI, >80% on dry basis)은 PEVESA BIOTECH S.A. (El Viso del Alcor, Sevilla, Spain)에서 제공받았다. 분리완두단백(7.5%, 10%, 12.5%, w/v)은 3차 증류수와 혼합하고, 단백질 부패방지를 위해 0.02% (w/v) sodium azide (Sigma-Aldrich, USA)를 첨가한 뒤 하루동안 실온에서 교반하였다. 다음날 초음파 분산기(ultrasonication, VCX-500, Sonics & Materials, USA) 를 이용하여 40Hz에서 5분(10 s ON, 5 s OFF) 동안 용액 을 균질화 한 후 6M HCL을 이용하여 pH 2로 적정하였 다. 그 후 혼합물은 겔 형성을 유도하기 위해 90°C에서 16 시간동안 300 rpm으로 교반하며 가열하였다. 실온(25°C)에 서 식힌 뒤 냉장고(4°C) 하루동안 안정화시켰다.

분리완두단백 응집체의 미세구조는 투과전자현미경(FETEM; JEOL, JEM-2000EX, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰 하였다. 각 pH가 조절된 증류수를 이용하여 100배 희석한 응집체 용액 한 방울을 투과전자현미경용 그리드(Support Flims Grid, TED PELLA, USA)에 30초간 고정시킨 후 2% uranyl acetate를 이용하여 30초간 음성 염색시켜 준비하였다.

단백질 겔의 미세구조는 Zeiss EVO MA 10 주사전자현 미경(FE-SEM; Inspect-F, FEI, Finland)을 사용하여 20 kV 의 가속 전압에서 관찰하였다. 제조된 겔을 액체 질소에서 동결시키고 동결 건조한 후 겔의 단면을 금으로 코팅하여 관찰하였다.

추가적으로 공초점 현미경(Confocal laser scanning microscope) (CLSM, Stellaris5, Leica, Wetzlar, Germany) 을 사용하여 겔의 미세구조를 분석하였다. 염색재료로 형 광염료인 nile red (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 isopropyl alcohol에 1 mg/mL의 농도로 희석하여 분리완두 단백 용액과 혼합하여 위의 방법에 따라 겔을 제조한 후, 488 nm 및 argon laser 조건에서 시료를 분석하였다.

제조된 단백질 겔의 텍스쳐 특성은 CTX texture analyzer (Brookfield Engineering Labs Inc., Stoughton, USA)를 사 용하여 분석하였다. 제조된 겔(두께 10 mm, 지름 13 mm)은 5 kg load cell과 a flat stainless-steel plate probe (TAAACC36) 를 이용하여 deformation 50% 및 test speed 1 mm/min 조건에서 2번 압축하였다. 얻어진 힘-시간 그래프로부터 텍스쳐 변수인 hardness (경도), springiness (탄력성) 및 cohesiveness (응집성)을 계산하였다. 각 시료의 측정치는 8 회 이상 반복 측정하여 평균값과 표준편차 값으로 나타내 었다.

보수력은 Lee and Jo (2023)의 방법을 이용하여 측정하 였다. 제조된 단백질 겔 2±0.1 g을 ultrafiltration tube (Vivaspin Turbo 50, MWCO 5 kDa, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Germany)에 넣고, 원심분리기(LaboGene 1736R, GYROGEN, Daejeon, Korea)를 이용하여 4,000 rpm으로 25°C에서 10분간 처리하였다. 원심분리 전과 후의 시료의 무게를 측정하여 다음의 식을 이용하여 보수력을 계산하였다.

pH 2에서 분리완두단백 현탁액의 열 유도 겔화 거동을 PP 50 (Parallel plate 직경: 50 mm, 간격: 1 mm)이 장착된 레오미터(MCR 302e, Anton Paar GmbH, Granz, Austria)를 이용하여 분석하였다. 온도는 P eltier 시스템을 사용하여 조 절하였으며, 측정 중 탈수를 방지하기 위해 실리콘 오일을 사용하였다. 시간-온도 변화시험은 1Hz의 진동수와 1%의 변형률을 사용하여 저장계수(G')와 손실계수(G'')를 기록하 였다. 먼저, 20°C에서 90°C까지 2°C/min의 속도로 증가시킨 후 90°C에서 1시간 동안 유지한 다음 4°C/min의 속도로 90°C에서 4°C로 냉각하였다. 그 후 1시간 동안의 냉각유지 단계를 거쳐 시간-온도 변화시험을 완결하였다. 추가적으로 레오미터 내에서 형성된 겔의 서로 다른 온도에서의 안정성 을 확인하기 위해 4°C, 25°C 또는 37°C에서 진동수 변화시 험(Frequency sweep test: 0.01-10 Hz)을 수행하였다.

변형률 변화시험(Strain sweep test)은 제조된 겔 시료 제 조된 겔(두께 10 mm, 지름 13mm)를 PP 25 (Parallel plate 직경: 25 mm, 간격: 1 mm)이 장착된 레오미터를 이용하여 분석하였다. 제조된 겔은 레오미터 내에서 원래 높이의 90%로 압축하여 P P 2 5 사이에 빈 공간 없이 위치시켰으 며, 변형률은 0.1%에서 100%까지의 수준으로 수행하였다.

통계분석은 S P SS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 24.0 IBM., Chicago, IL, USA)을 사용하였으며, 시료간 유의적 차이를 검증하기 위해 일원 배치분산분석 후, Duncan’s multiple range test에 따라 사 후검증을 실시하여 p˂0.05 유의수준에서 시료간의 유의성 을 검증하였다.

분리완두단백기반 하이드로겔의 형성을 확인하고 물성학 적 특성을 조사하기에 앞서, 서로 다른 pH에서의 겔화 능 력을 확인하기 위하여 분리완두단백 10% 용액을 pH 2, pH 7 및 pH 11에서 6시간 동안 가열 후의 겔화 능력을 평가하였다(Fig. 1). 그 결과, pH 2에서는 단백질 겔 형성 을 확인하였으며, pH 7에서는 약한 겔이, pH 11에서는 겔 형성이 진행되지 않은 것을 확인하였다. 따라서, 본 연구에 서는 pH 2의 산성조건에서 서로 다른 단백질 농도(7.5%, 10%, 12.5%) 및 가열시간(1, 3, 6, 16시간)에 따른 분리완 두단백 겔 형성 능력을 비교 분석하였다.

Fig. 1. Appearance of heat-induced gels (10% protein) prepared at p H 2, pH 7 and pH 11. All gels were prepared at heating time of 6 h.

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Fig. 2는 시각적 튜브반전법(visual tube-inversion method) 으로 분리완두단백으로부터의 겔 형성 능력을 나타낸 결과 이다. 일반적으로 단백질 기반 하이드로겔은 단백질의 일 정농도 이상에서 형성되며, 이 때의 농도를 단백질 임계농 도(critical protein concentration)라 하며 겔화 능력의 지표 로 사용한다. 단백질 임계농도가 낮을수록 겔을 형성하는 데 필요한 단백질 함량이 적다는 것을 의미한다(Nicolai & Chassenieux, 2019;Jo et al., 2020). Fig. 2에 제시한 대로 pH 2에서 분리완두단백의 겔화를 위한 임계농도는 10% 이상(가열시간 6시간)으로 보이며, 가열시간이 증가함에 따라 겔화를 위한 단백질 임계농도는 감소하는 것으로 나타났다. 즉, 가열 시간이 6시간에서 3시간으로 감소함에 따라 분리 완두단백 겔 형성에 요구되는 단백질 농도가 10%에서 12.5% 으로 증가하였다. 따라서, 자립형 겔(self-standing gel) 형성 을 위해서는 최소 10% 이상의 분리완두단백과 최소 3시간 이상의 가열시간이 필요함을 시사한다. 이는 단백질 변성 온도에서 단백질 농도와 가열시간이 상호 의존성이 있기 때문에 분리완두단백 겔화는 pH뿐만 아니라 단백질농도와 가열시간을 동시에 고려해야 한다는 것을 의미한다.

Fig. 2. Phase diagram of heat-induced gels prepared with PPI at different PPI concentration and heating time. Image of gels prepared at 3 h heating time and at different PPI concentration: (×: 7.5% PPI) aggregates (liquid), (: 10% PPI) weak-gel, (●: 12.5% PPI) gel.

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Fig. 3는 열 유도 분리완두단백 응집체의 미세구조를 나 타낸 TEM 이미지이며, 이는 단백질 농도 7.5%에서 가열시 간 3시간 동안 처리되었다. 이 조건에서 단백질 분자는 변 성되고 응집되며, 그 결과 5 nm 크기 내외의 불균일한 구형 의 응집체(aggregates) 분산이 관찰되었다. 이러한 응집체는 가열시간의 증가로 인해 충분한 단백질 풀림(unfolding)을 일으키고, 활성 그룹이 노출되어 상호 연결된 3차원 하이드 로겔 형성하게 된다(Jo et al., 2020).

Fig. 3. TEM image of heat-induced aggregates prepared with pea protein isolate at 7.5% PPI 3 h- heating time. Scale bar: 10 μm.

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서로 다른 단백질 농도(10%, 12.5%) 및 가열시간(3, 6, 16시간)에 따른 분리완두단백 겔의 미세 구조(CLSM 및 SEM 이미지)를 Fig. 4에 제시하였다. Fig. 4A에 나타낸 SEM 이미지의 경우, 같은 가열 시간 하에 겔의 단백질 농 도가 10%에서 12.5%로 증가함에 따라 더욱 조밀하고 균 일한 기공 분포를 가진 미세 구조가 형성되었다. 이는 높 은 단백질 농도가 보다 우세한 단백질-단백질 사이에 상호 작용을 증가시켜 고도로 연결된 겔 네트워크 구조를 나타 냄을 의미한다(Jo et al., 2020). 또한, 예상한 바와 같이 같 은 단백질 농도에서 겔의 가열 시간이 3시간에서 6시간, 16시간으로 차례로 증가함에 따라 매우 균질하고 상호 연 결된 겔 네트워크가 형성됨을 확인하였다. 이러한 SEM 이 미지 결과는 Fig. 4B에 제시된 CLSM 이미지 결과와 유사 하게 나타났다. CLSM 이미지에서 붉은색 점으로 표시된 것이 단백질 입자들의 분포 형태를 의미하며, 단백질 겔 네트워크의 밀도가 단백질 농도 및 가열시간과 비례 관계 가 있음을 나타낸다. 즉, 단백질 농도 및 가열시간이 증가 함에 따라 겔을 형상하고 있는 단백질 입자(응집체)가 매 우 고르게 분포하여 겔의 네트워크의 균질성을 보여준다. 본 연구결과는 콩, 렌틸 및 녹두 단백질로부터 열 유도된 하이드로겔의 미세구조 특성과 동일한 결과를 나타내었다 (Jo et al., 2020;Lee & Jo, 2023). 따라서, 이는 단백질 농도 및 가열 시간의 증가가 균일하고 조밀한 겔 미세구조 형성에 영향을 미친다는 것을 시사하며, 겔 미세구조의 특 성은 겔의 기계적 강도 및 물성학적 영향에도 영향을 미칠 것이라 판단된다.

Fig. 4. SEM images (A) and CLSM images (B) of heat-induced PPI gels with different PPI concentration (10%: a, b; 12.5%: c, d, e) and heating t ime (3 h: c ; 6 h: a, d ; 16 h: b , e) .

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Fig. 5는 단백질 농도 변화(10%, 12.5%)와 가열 시간 변 화(3-16 h)에 따른 분리완두단백 열 유도 겔의 기계적 특성 (Fig. 5A and B)과 보수력(Fig. 5C)을 나타낸 결과이다. 일 반적으로 조직감과 보수력은 겔화 식품을 섭취하였을 때 혀와 치아에 의해 다즙성 및 용이한 섭취능력을 비교하는 평가하는 기준이 된다(Lee & Jo, 2023). Fig. 5A와 같이 단백질 농도가 증가할수록 겔 강도는 유의적인 증가를 보 였으며, 이는 높은 단백질 농도에서 우세한 단백질 입자간 상호작용에 의해 조밀한 겔 네트워크 형성을 유도하였음을 의미한다. 예측한바와 같이 가열시간의 증가에서도 겔 강 도를 증가시키는 경향을 보였으며, 이는 완두단백질 분자 의 활성그룹의 전개에 의해 응집체 형성이 유도되었고, 그 결과 높은 겔 강도를 갖는 안정적이고 단단한 겔이 제조되 었음을 나타낸다. 이러한 겔 강도 증가에 따른 결과는 SEM 결과와 일치한다. 게다가, 제조된 겔의 탄력성 또한 겔의 강도와 유사한 경향성을 나타내었다. 탄력성은 겔에 가해진 힘이 제거된 후 처음 높이를 회복하는 정도를 나타 내며, Fig. 5A에서 보는 바와 같이, 단백질 함량이 높을수 록 가열시간이 길수록 겔의 탄력성이 증가하는 경향을 보 였으며, 특히 10% 단백질/16 h 가열시간의 겔 시료와 12.5% 단백질/3 h 가열시간의 겔 시료의 겔 강도 및 탄력 성이 유사한 것으로 나타났다. 그러나 겔 미세구조에서는 비교적 낮은 단백질 함량이라도 높은 가열시간에서 제조된 겔의 미세구조가 더욱 균일하게 관찰되었다.

Fig. 5. Mechanical properties (A: hardness, springiness) and water-holding capacity (WHC) (B) of heat-induced PPI gels with different heating PPI concentration (10% and 12.5%) and heating time (3 h, 6 h and 16 h). Different letters (A-C, a-c) are significantly different (p<0.05).

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겔의 응집성은 겔 내부의 결합의 강도를 나타내는 지표 이며, 이는 겔 네트워크 구조를 형성하는 연속성과 밀접한 관련이 있다(Lee & Jo, 2023). 따라서, 응집성은 응력에 저항할 수 있는 구조가 필요한 식품제형의 중요한 특성을 나타낸다. Fig. 5B에 보는 바와 같이, 겔의 응집성은 단백 질 함량 및 가열시간이 증가함에 따라 유의적으로 감소하 는 것으로 나타났다. 이는 높은 단백질 함량과 가열시간으 로 제조된 겔의 경우 겔의 내부 결합이 약해지면서 구조가 많이 파괴되어 취성(부서지는 성질)의 특성이 우세하게 나 타냄을 의미한다. 이러한 결과는 분리녹두단백으로 제조된 겔의 특성과 동일하다(Lee & Jo, 2023).

겔의 보수력은 식품(특히, 육제품)에서 부드러운 수분감 을 제공하는 중요한 요소이다. 본 연구 결과, 보수력은 단 백질 함량이 10%에서 12.5%로 증가함에 따라서는 유의미 하게 증가했으나, 가열 가열시간의 증가에 따라서는 유의 미한 차이를 보이지 않았다(Fig. 5C). 수분 함량을 더 잘 유지하는 것에 있어 더 높은 단백질 함량으로 제조된 겔 내부의 더 작고 균일한 기공 크기로 더 많은 수분보유능력 을 가질 수 있음을 시사한다. 또한 분리완두단백으로 제조 된 겔의 경우 전체적으로 84% 이상의 우수한 겔화 능력을 보여주었으며, 이는 다른 식물성 단백질(예, 콩, 땅콩, 렌틸 단백질)과 유사한 수준으로 나타났다(Jo et al., 2020;Li et al., 2020;Wang et al., 2022).

pH 2에서 분리완두단백 현탁액으로부터 겔화 거동을 조 사하기 위한 시간-온도 변화에 따른 유변학적 특성을 Fig. 6A에 나타내었다. 유변학적 특성에서 물질의 점탄성 성질 을 예측할 때 저장계수(G')는 탄성, 손실계수(G'')는 점성을 나타내는 물성학적 지표로 사용된다. Fig. 6A에 나타낸 바 와 같이, G'은 가열단계 (20°C®90°C)에서 급격한 증가를 보여주고 있으며, 특히 50°C 이상에서는 G'보다 G''가 더 큰 것으로 보인다. 이는 50°C 이상에서 고체 점탄성 (G'>G'') 성질이 강하게 나타나 단백질 겔화가 우세하게 작 용되었음을 시사한다. 그 후 가열유지단계에서 G'의 완만 한 증가를 보였으며, 5도까지 냉각단계(90°C→5°C)에서도 급격한 G' 증가를 나타내었다. 냉각단계동안 G'의 증가는 겔을 형성하기 위한 단백질 입자(응집체)의 이동성 감소를 인한 것으로 판단된다(Jo et al., 2020). 또한, 냉각유지단계 동안 G'은 일정하게 나타났으며, 이는 냉각유지단계가 겔 의 안정화에 기여할 수 있음을 시사한다.

Fig. 6. Rheological properties of PPI suspension (10%, w/v) for the formation of heat-induced gel. (A) A time-temperature gelation profile; (B) Frequency dependence of storage modulus (G') and loss modulus (G') as a function of cooling time (0, 0.5, 1 h). All samples for heat-induced gelation were heated from 20°C to 90°C at 2°C/min, held at 90°C for 1 h, cooled from 90°C to 5°C at 4°C/min, and held at 4°C for 1 h (frequency of 1 Hz, strain 1%). All frequency sweep measurements performed at different temperature (4, 25, 37°C) after the temperature sweep test. The temperature is depicted in the black dashed line. Full lines indicate storage modulus (G'), and the dashed line indicate loss modulus (G''). The temperature is depicted by the black full line.

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Fig. 6B는 시간-온도 변화 시험 후에 레오미터 내에서 제조된 단백질 겔의 진동수(frequency) 변화시험을 측정한 결과이다. 진동수 변화시험은 단백질 겔에 변형률을 가하 는 시간을 달리했을 때 점탄성 변화를 측정한다. 일반적으 로 점탄성 성질을 가는 단백질 겔의 경우 변형이 가해지는 속도가 느리면 액체와 같은 특성을 확인할 수 있고, 변형 속도가 빨라질수록 고체적 성질이 강해지는 것을 관찰할 수 있다(Mezger, 2020). 즉, 점탄성-진동수 그래프의 기울 기가 클수록 제조된 단백질 겔이 물리적으로 불안정(액체 적 성질이 강함)하며, 기울기가 작을수록 안정(고체적 성질 이 강함)함을 의미한다. Fig. 6B는 시간-온도 변화 시험의 냉각유지단계 이후 온도의 변화(4°C, 25°C, 37°C)를 주어 겔의 안정성을 평가하였다. 고체적 성질인 탄성을 나타내 는 물성학적 지표인 G'은 온도가 낮을 수록 점탄성의 진동 수 의존성이 낮아짐을 보여주었다. 즉 점탄성-진동수 그래 프의 기울기가 낮기 때문에 겔의 안정성이 상대적으로 낮 은 온도(4°C)에서 더 유리함을 보여준다. 이러한 낮은 온도 에서의 진동수 변화에 의한 비의존성은 형성된 겔이 수소 결합에 의해 안정화가 이루어지며, 이는 저온에서 더욱 강 화될 수 있음을 시사한다.

추가적으로 제조된 분리완두단백 하이드로겔의 파단 (fracture) 능력을 평가하기 위하여 변형률(strain) 변화시험 을 진행하였다(Fig. 7). 변형률 변화시험은 일반적으로 식품 가공 및 섭취에 실질적인 영향을 미치고, 겔을 파괴할 수 있는 임계 응력(break to critical stress)을 측정할 수 있다 (Alavi et al., 2020). 이 때, 항복응력(yield stress)는 손실계 수가 저장계수보다 우세하는 지점(즉, tan δ>1.0)의 탄젠트 (tan δ) 값 분석에 의해 결정된다(Jo & Chen, 2023). Fig. 7A에 나타낸 바와 같이, 변형률(Strain%)를 증가시키면서 점탄성을 측정함으로써 일정한 선형 점탄성 구간을 얻을 수 있다. 이 때 이 선형구간이 짧을수록 고체의 성질이 강하 며, 선형구간이 길수록 액체의 성질을 나타내는데(Mezger, 2020), 단백질 농도가 낮을수록 가열시간이 짧을수록 선형 구간이 길어져 액체적 성질을 강하게 나타내는 것으로 나 타났다(Fig. 7A). 이를 항복응력과 임계 변형률 값으로 환 산한 결과(Fig. 7B), 단백질 농도 및 가열시간의 증가는 항 복응력이 높게 측정되었다. 단백질 겔의 항복응력은 단백 질-단백질 상호작용의 증가, 겔 네트워크 구조의 안정성, 겔 미세구조의 특성 등과 같은 다양한 매개변수에 영향을 받을 수 있다. 본 연구결과에서 관찰된 항복응력의 증가는 단백질 응집체의 우세한 상호작용에 의한 단단한 겔 형성 으로 설명될 수 있으며, 반면 임계 변형률의 감소는 형성된 겔이 부서지기 쉬운 조직감을 가지고 있음을 예측할 수 있 다. 이러한 임계 변형률 감소로 인한 부서지기 쉬운 조직 감은 위의 T PA의 결과에서 응집력 측정 결과와 일치한다.

Fig. 7. Storage modulus (G')- strain profiles (A) and yield stress and critical strain (B) of heat-induced gels with different heating PPI concentration (10% and 12.5%) and heating time (3 h, 6 h and 16 h). Different letters (A-C, a-c) are significantly different (p<0.05).

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